Verschil Tussen Northern Southern En Western Blotting

2024 Auteur: Mildred Bawerman | [email protected]. Laatst gewijzigd: 2023-12-16 08:40

Belangrijkste verschil - Northern vs Southern vs Western Blotting

Detectie van specifieke sequenties van DNA, RNA en eiwitten is essentieel voor verschillende soorten onderzoeken in de moleculaire biologie. Gelelektroforese is een techniek die DNA, RNA en eiwitten scheidt op basis van hun grootte. Van de gelprofielen wordt een bepaalde DNA-sequentie, RNA-sequentie of eiwit gedetecteerd door de speciale technieken die blotting en hybridisatie met gelabelde probes worden genoemd. Er zijn drie verschillende soorten blotting-methoden, namelijk zuidelijk, noordelijk en westelijk. Het belangrijkste verschil tussen Northern Southern en Western blotting ligt in het type molecuul dat het uit een monster detecteert. Southern blotting is een methode die een specifieke DNA-sequentie detecteert uit een DNA-monster. Northern blotting is een techniek die een specifieke RNA-sequentie detecteert uit een RNA-monster. Western blotting is een methode die een specifiek eiwit uit een eiwitmonster detecteert.

INHOUD

1. Overzicht en belangrijkste verschil

2. Wat is Southern Blotting

3. Wat is Northern Blotting

4. Wat is Western Blotting

5. Vergelijking zij aan zij - Northern vs Southern Blotting

6. Samenvatting

Wat is Southern Blotting?

De Southern blotting-techniek werd in 1975 door EM Southern ontwikkeld voor de identificatie van een specifieke DNA-sequentie uit een DNA-monster. Dit is de eerste blotting-techniek die in de moleculaire biologie is geïntroduceerd. Het maakte de detectie mogelijk van specifieke genen uit het DNA, specifieke fragmenten uit DNA, enz. Er zijn verschillende stappen betrokken bij de Southern blotting-techniek. Ze zijn als volgt.

1. DNA wordt uit het monster geïsoleerd en gedigereerd met restrictie-endonucleasen.
2. Het verteerde monster wordt gescheiden door middel van agarosegelelektroforese.
3. DNA-fragmenten in de gel worden gedenatureerd tot enkele strengen met behulp van een alkalische oplossing.
4. Enkelstrengs DNA wordt overgebracht naar een nitrocellulose filtermembraan door middel van capillaire overdracht.
5. Overgedragen DNA wordt permanent op het membraan gefixeerd.
6. Vast DNA op het membraan wordt gehybridiseerd met gelabelde probes.
7. Ongebonden DNA wordt van het membraan afgewassen door te wassen.
8. Röntgenfilm wordt blootgesteld aan het membraan en er wordt een autoradiogram gemaakt.

Southern blotting wordt toegepast voor verschillende aspecten van moleculaire biologie. Het is nuttig bij het in kaart brengen van RFLP, forensische studies, DNA-methylatie bij genexpressie, detectie van gemuteerde genen bij genetische aandoeningen, DNA-vingerafdrukken, enz.

Figuur 01: Southern Blotting-techniek

Wat is Northern Blotting?

Northern blotting is een methode die is ontworpen om een specifieke RNA-sequentie of mRNA-sequentie van een monster te detecteren om genexpressie te bestuderen. Deze techniek is in 1979 ontwikkeld door Alwine, Kemp en Stark. Het verschilt van de zuidelijke en westerse blottingtechnieken door verschillende stappen. Deze techniek wordt echter ook uitgevoerd via gelelektroforese, blotting en hybridisatie met specifieke gelabelde probes en detectie. De Northern blotting-techniek wordt als volgt uitgevoerd.

1. RNA wordt uit het monster geëxtraheerd en gescheiden door gelelektroforese.
2. RNA wordt van de gel overgebracht naar een blotting-membraan en gefixeerd.
3. Het membraan wordt behandeld met een gemerkte sonde die is bereid uit cDNA of RNA (de sonde is complementair aan een specifieke sequentie in het monster).
4. De sonde wordt met het membraan geïncubeerd om met een specifieke sequentie te binden.
5. Niet-gebonden sondes worden afgewassen.
6. Gehybridiseerde fragmenten worden gedetecteerd door een autoradiogram.

Northern blotting is een belangrijk hulpmiddel bij het detecteren en kwantificeren van gehybridiseerd mRNA, het bestuderen van RNA-afbraak, het evalueren van de RNA-halfwaardetijd, het detecteren van RNA-splitsing, het bestuderen van genexpressie, enz.

Figuur 02: Northern Blotting

Wat is Western Blotting?

Western blotting is een methode om een specifiek eiwit uit een eiwitmengsel te detecteren met behulp van gelabeld antilichaam. Daarom wordt western blot ook wel een immunoblot genoemd. Deze techniek werd in 1979 geïntroduceerd door Towbin et al en wordt nu routinematig uitgevoerd in de laboratoria voor eiwitanalyse. De stappen zijn als volgt.

1. Eiwitten worden uit het monster gehaald
2. Eiwitten worden gescheiden door hun grootte met behulp van polyacrylamidegelelektroforese
3. Gescheiden moleculen worden door elektroporatie overgebracht naar een PVDF-membraan of nitrocellulosemembraan
4. Het membraan is geblokkeerd voor niet-specifieke binding met de antilichamen
5. Overgedragen eiwitten worden gebonden met primair antilichaam (enzym-gelabelde antilichamen).
6. Het membraan wordt gewassen om niet-specifiek gebonden primaire antilichamen te verwijderen
7. Gebonden antilichamen worden gedetecteerd door een substraat toe te voegen en het gevormde gekleurde neerslag te detecteren

Western blotting is nuttig bij de detectie van anti-HIV-antilichamen in een menselijk serummonster. Western blot kan ook worden gebruikt als een bevestigende test voor hepatitis B-infectie en als definitieve test voor de gekkekoeienziekte.

Figuur 03: Western Blotting

Wat is het verschil tussen Northern Southern en Western Blotting?

Diff Artikel Midden voor Tafel

Northern vs Southern vs Western Blotting
Type molecuul gedetecteerd
Northern Blotting	Northern blotting detecteert een specifieke RNA-sequentie uit een RNA-monster.
Southern Blotting	Southern blotting detecteert een specifieke DNA-sequentie uit een DNA-monster.
Western blotting	Western blotting detecteert een specifiek eiwit uit een eiwitmonster.
Type gel
Northern Blotting	Dit maakt gebruik van agarose / formaldehyde-gel.
Southern Blotting	Dit maakt gebruik van een agarosegel.
Western blotting	Dit maakt gebruik van polyacrylamidegel.
Blotting-methode
Northern Blotting	Dit is een capillaire overdracht.
Southern Blotting	Dit is een capillaire overdracht.
Western blotting	Dit is een elektrische overdracht.
Gebruikte sondes
Northern Blotting	cDNA- of RNA-probes radioactief of niet-radioactief gelabeld.
Southern Blotting	DNA-sondes worden radioactief of niet-radioactief gelabeld.
Western blotting	Primaire antilichamen worden als sondes gebruikt.
Detectiesysteem
Northern Blotting	Dit gebeurt met behulp van een autoradiograaf, of detectie van licht- of kleurverandering.
Southern Blotting	Dit gebeurt met behulp van een autoradiograaf, detectie van licht of kleurverandering.
Western blotting	Dit gebeurt met behulp van detectie van licht- of kleurverandering.

Samenvatting - Northern vs Southern vs Western Blotting

Blotting is een speciale techniek die is ontwikkeld voor de identificatie van specifiek DNA, RNA of eiwit uit de monsters. Er zijn drie afzonderlijke blotting-procedures, namelijk noordelijk, zuidelijk en westelijk, om een specifiek type molecuul te detecteren. Northern blotting-techniek is ontworpen om een specifieke RNA-sequentie te detecteren uit een mengsel van RNA. De Southern blotting-techniek maakt de detectie mogelijk van een specifieke DNA-sequentie uit een DNA-monster en de Western-blotting-techniek is ontwikkeld om een specifiek eiwit uit een eiwitmengsel te identificeren.