Belangrijkste verschil - PCR-primers versus sequencing-primers
Met de recente ontwikkelingen op het gebied van moleculaire biologie, werden verschillende genetische technieken ontwikkeld die de onderzoeksprocessen van verschillende wegen van het onderwerp gemakkelijk en nauwkeurig maakten. PCR en andere sequentiebepalingsprocedures zijn twee belangrijke dergelijke technieken. Ze gebruiken verschillende subcomponenten. Primers worden beschouwd als de belangrijkste subcomponent die gemeenschappelijk is voor zowel PCR- als sequentietechnieken. PCR-primers worden gebruikt voor amplificatie van een bepaalde DNA-sequentie, terwijl sequencing-primers worden gebruikt in de context van het sequencen van een DNA-fragment met de bedoeling de specifieke volgorde van de nucleotidesequentie te onthullen. Dit is het belangrijkste verschil tussen PCR-primers en sequencing-primers.
INHOUD
1. Overzicht en belangrijkste verschil
2. Wat zijn PCR-primers
3. Wat zijn sequencing-primers
4. Overeenkomsten tussen PCR-primers en sequencing-primers
5. Vergelijking zij aan zij - PCR-primers versus sequencing-primers in tabelvorm
6. Samenvatting
Wat zijn PCR-primers?
Polymerase Chain Reaction (PCR) is een genetische techniek die wordt gebruikt in de moleculaire biologie om een enkele of enkele kopieën van een bepaald DNA-segment te amplificeren en vele miljoenen identieke kopieën te verkrijgen. In een PCR-reactie worden verschillende componenten gebruikt, waaronder primers. Primers zijn korte DNA-strengen met een nucleotidenlengte van 18-25 waardoor ze compatibel zijn met het begin- en eindgebied van de te amplificeren DNA-fragmenten. Primers kunnen een voorwaartse primer en een omgekeerde primer zijn. Deze primers binden aan het DNA-fragment op de specifieke punten waar het DNA-polymerase laat binden aan de specifieke primer op de locatie en de synthese van de nieuwe DNA-streng in gang zet.
De selectie van primers is een belangrijk aspect van het PCR-proces. De keuze van de lengte van de primer is belangrijk. De ideale lengte zou 18-25 nucleotiden zijn. Als de lengte te kort of te lang is, zullen de primers niet binden aan de DNA-sequentie die nauwkeurig moet worden geamplificeerd. Primers met een te korte lengte leiden tot niet-specifieke primer-annealing op verschillende locaties van de DNA-sequentie.
Figuur 01: PCR-primers
Het gehalte aan Guanine en Cytosine (GC) in een goede primer moet tussen de 40 en 60 liggen. De primer gloeitemperatuur en smelttemperatuur zijn vitale factoren tijdens PCR. De smelttemperatuur moet nauwkeurig worden berekend en de gloeitemperatuur van de primer moet 5 ° C lager zijn dan de smelttemperatuur. De smelttemperatuur moet 60 ° C en 75 ° C zijn. Te hoge of te lage temperaturen zullen resulteren in minder actieve DNA-polymerase-activiteit.
Wat zijn sequencing-primers?
Sequentie-primers worden gebruikt in de context van het sequencen van een DNA-fragment met de bedoeling zijn specifieke identiteit te onthullen. Voor het verkrijgen van goede sequentieresultaten zijn primers en sjablonen van hoge kwaliteit belangrijk. Dus wanneer primers worden geselecteerd, zouden ze uniek moeten zijn voor een bepaald gebied waar we sequentie willen hebben. Het moet ook met een juiste oriëntatie zijn waar de sequenties gewoonlijk worden gegenereerd van 3 'tot 5' uiteinden van de primers. De sequentie zou ongewenste zelfhybridisatie moeten missen, zoals de vorming van haarspeldlussen. Het mag geen opeenvolgende vorming van Guanine-basen bevatten.
De smelttemperatuur (Tm) van de primer moet geschikt zijn voor de omstandigheden van de volgordebepaling. Daarom moet het tussen 52 o C en 74 o C liggen. Bereiding van oligonucleotiden die als primer worden gebruikt, moet worden gezuiverd om de gewenste volledige lengte van de sequentie te verkrijgen. Als de oligonucleotiden onzuiverheden bevatten, zal de primersequentiesignalering worden overgebracht vanaf verschillende priming-sites, en het zal ook het aantal basiscellen verminderen.
Figuur 02: Sequencing-primers
De primersmelttemperatuur (Tm) van een oligonucleotide bepaalt hoe sterk de complementaire DNA-strengen met elkaar worden gehybridiseerd. Tm kan worden beschouwd als een thermodynamische berekening waarbij het afhankelijk is van zowel DNA-sequenties als verschillende condities zoals zoutconcentratie. De Tm is belangrijk tijdens PCR waar een variant genaamd de cyclussequentiebepaling wordt gebruikt om een groep met dideoxynucleotide beëindigde fragmenten te produceren. Hier wordt de primer waarvan de sequentie wordt bepaald, aanvankelijk afwisselend uitgegloeid, vervolgens verlengd en ten slotte gedenatureerd voor amplificatie. Daarom moet de Tm-waarde tussen 52 o C en 74 o liggenC. Gesynthetiseerde oligonucleotiden kunnen naar keuze worden verkregen bij DNA / RNA-syntheselaboratoria. De kleinschalige syntheseschaal die wordt gebruikt voor DNA-sequentiebepaling is meestal 50 nmol. Het belangrijkste is ook dat de primers die voor sequencing worden gebruikt, moeten worden gezuiverd om vrij te zijn van onzuiverheden die kwaliteitsverlies voorkomen.
Wat zijn de overeenkomsten tussen PCR-primers en sequencing-primers?
- Zowel PCR-primers als sequencing-primers zijn primers die worden gebruikt in het amplificatieproces van een gerichte DNA-sequentie.
- Zowel PCR-primers als sequencing-primers zijn samengesteld uit nucleotiden.
- Zowel PCR-primers als sequencing-primers zijn korte oligomeren.
Wat is het verschil tussen PCR-primers en sequencing-primers?
Diff Artikel Midden voor Tafel
PCR-primers versus sequencing-primers |
|
| PCR-primers zijn korte DNA-strengen met een nucleotidesequentielengte van 18-25, waardoor ze compatibel zijn met het begin- en eindgebied van de te amplificeren DNA-fragmenten. | Sequencing-primers zijn korte oligomeren die worden gebruikt in de context van het sequencen van een DNA-fragment met de bedoeling zijn specifieke identiteit te onthullen. |
| Functie | |
| PCR-primers worden gebruikt voor amplificatie van een bepaalde DNA-sequentie. | Sequencing-primers worden gebruikt in de context van het sequencen van een DNA-fragment met de bedoeling zijn specifieke identiteit te onthullen. |
| Aantal benodigde primers | |
| Twee primers; één voorwaartse primer en één omgekeerde primer worden gebruikt als PCR-primers. | Slechts één primer nodig als sequencing-primer. |
Samenvatting - PCR-primers versus sequencing-primers
Sequentie-primers worden gebruikt in de context van het sequencen van een DNA-fragment met de bedoeling zijn specifieke identiteit te onthullen. Eén sequencing-primer is voldoende om het proces uit te voeren. Om goede sequentieresultaten te verkrijgen, zijn primers en sjablonen van hoge kwaliteit belangrijk. Dus wanneer primers worden geselecteerd, zouden ze uniek moeten zijn voor een bepaald gebied waar we sequentie willen hebben. PCR-primers zijn korte DNA-strengen met een nucleotidenlengte van 18-25 die compatibel is met het start- en eindgebied van de DNA-fragmenten die moeten worden geamplificeerd. PCR-primers kunnen een voorwaartse primer en een omgekeerde primer zijn. Het gehalte aan Guanine en Cytosine (GC) in een goede primer moet tussen de 40 en 60 liggen. De primer gloeitemperatuur en smelttemperatuur zijn vitale aspecten tijdens PCR. Dit is het verschil tussen PCR-primers en Sequencing-primers.
