Belangrijkste verschil - PCR versus DNA-sequencing
PCR en DNA-sequentiebepaling zijn twee belangrijke technieken in de moleculaire biologie. Polymerase Chain Reaction (PCR) is het proces waarbij een groot aantal kopieën van een DNA-fragment wordt gemaakt. DNA-sequencing is de techniek die resulteert in de exacte volgorde van de nucleotiden van een bepaald DNA-fragment. Dit is het belangrijkste verschil tussen PCR- en DNA-sequentiebepaling. PCR is een van de belangrijkste stappen bij het bepalen van de DNA-sequentie.
INHOUD
1. Overzicht en belangrijkste verschil
2. Wat is PCR
3. Wat is DNA-sequentiebepaling
4. Vergelijking zij aan zij - PCR versus DNA-sequentiebepaling
5. Samenvatting
Wat is PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) is een DNA-amplificatietechniek die wordt gebruikt in Molecular Biology. Het produceert duizenden tot miljoenen kopieën van een bepaald DNA-fragment. Deze methode is ontwikkeld door Kary Mullis in 1983. Bij deze techniek dient het fragment van het te amplificeren DNA als de matrijs en voegt het DNA-polymerase-enzym complementaire nucleotiden toe aan de primer die beschikbaar is in het PCR-mengsel. Aan het einde van de PCR-reactie worden veel kopieën van het monster-DNA gesynthetiseerd.
Er zijn verschillende componenten van het PCR-mengsel, waaronder DNA, DNA-polymerase (Taq-polymerase), primers (voorwaartse en omgekeerde primers), nucleotiden (bouwstenen van DNA) en een buffer. PCR vindt plaats in een PCR-machine en het juiste PCR-mengsel moet in de machine worden geladen en het juiste programma moet worden aangestuurd. Deze techniek maakt de productie van duizenden tot miljoenen kopieën van een bepaald stukje DNA mogelijk uit een zeer kleine hoeveelheid DNA.
PCR-reacties vinden op een cyclische manier plaats om de zichtbare hoeveelheid PCR-producten op een gel te produceren. Er zijn drie belangrijke stappen betrokken bij een PCR-reactie, namelijk denaturatie, primer-annealing en strengverlenging, zoals weergegeven in Figuur 01. Deze drie stappen vinden plaats bij drie verschillende temperaturen. DNA bestaat in dubbelstrengs vorm door waterstofbruggen tussen de complementaire basen. Voorafgaand aan de implicatie moet dubbelstrengs DNA van elkaar worden gescheiden. Het wordt gedaan door een hoge temperatuur te geven. Bij een hoge temperatuur denatureert dubbelstrengs DNA tot enkele strengen. Dan moeten de primers dichter bij de flankerende uiteinden van het specifieke fragment of het gen van het DNA komen. Primer is een kort stukje enkelstrengs DNA dat complementair is aan de doelsequentie. Voorwaartse en omgekeerde primers versmelten met de complementaire basen aan de flankerende uiteinden van het gedenatureerde monster-DNA bij de versmeltingstemperatuur. Primers moeten hittebestendig zijn. Zodra primers versmelten met monster-DNA, initieert taq-polymerase-enzym de synthese van de nieuwe strengen door nucleotiden toe te voegen die complementair zijn aan het doel-DNA. Taq-polymerase is een hittestabiel enzym dat wordt geïsoleerd uit een thermofiele bacterie genaamd Thermus aquaticus. PCR-buffer handhaaft de optimale omstandigheden voor de taq-polymerase-actie. Deze drie stadia van PCR-reacties worden herhaald om de vereiste hoeveelheid PCR-product te produceren. Na elke PCR-reactie wordt het aantal DNA-kopieën verdubbeld. Daarom kan een exponentiële versterking worden waargenomen in PCR. PCR-producten kunnen worden waargenomen met behulp van gelelektroforese en kunnen worden gezuiverd voor verder onderzoek.
Figuur 01: belangrijke stappen van een PCR-reactie
PCR is een waardevol hulpmiddel bij medisch en biologisch onderzoek. PCR heeft een bijzondere waarde in de forensische wetenschap, omdat het DNA kan versterken voor studies van de kleine monsters van criminelen en forensische DNA-profielen kan maken. PCR wordt veel gebruikt in veel gebieden van de moleculaire biologie, waaronder genotypering, genklonen, mutatiedetectie, DNA-sequentiebepaling, DNA-microarrays en vaderschapstesten, enz.
Figuur 02: Polymerase-kettingreactie
Wat is DNA-sequencing?
DNA-sequentiebepaling is de bepaling van een precieze volgorde van de nucleotiden - adenine, guanine, cytosine en thymine in een bepaald DNA-fragment. Genetische informatie wordt in de DNA-sequenties opgeslagen in de juiste volgorde van de nucleotiden. Daarom is het vinden van de precieze volgorde van de nucleotiden in een DNA-fragment erg belangrijk om te weten over de structuur en functie van de genen.
Bij het protocol voor DNA-sequentiebepaling zijn verschillende processen betrokken. De eerste stap is het isoleren van geïnteresseerd DNA of genomisch DNA van een organisme. Met behulp van PCR (zoals hierboven beschreven), moet het gewenste gebied van het DNA worden geamplificeerd. Geamplificeerd PCR-product moet worden gescheiden door de gelelektroforese en gezuiverd. Geamplificeerde fragmenten worden gebruikt als sjablonen voor sequentiebepaling. Sequencing kan worden uitgevoerd volgens Sanger-sequencing of sequencing-methode met hoge doorvoer. Sanger-sequencing vereist capillaire elektroforese van resulterende DNA-fragmenten. Het bepalen van de juiste nucleotidevolgorde kan worden gedaan door handmatige aflezing van autoradiografieën of met behulp van geautomatiseerde DNA-sequencers.
Gensequencing droeg bij aan het Human Genome-project en vergemakkelijkte het in kaart brengen van het menselijk genoom in 2003. In forensisch onderzoek maakte DNA-sequencing de identificatie mogelijk van individuen die unieke DNA-sequenties tonen en de criminelen identificeren. In de geneeskunde kan DNA-sequencing worden gebruikt om de genen te detecteren die verantwoordelijk zijn voor genetische en andere ziekten, defecte genen te vinden en deze te vervangen door de juiste genen. In de landbouw wordt DNA-sequentie-informatie van sommige micro-organismen gebruikt om transgene gewassen te produceren met economisch gewenste eigenschappen.
Figuur 03: DNA-sequentiebepaling
Wat is het verschil tussen PCR en DNA-sequencing?
Diff Artikel Midden voor Tafel
PCR versus DNA-sequentiebepaling |
|
| PCR-proces creëert duizenden tot miljoenen kopieën van het geïnteresseerde DNA-fragment. | DNA-sequentiebepaling is het proces waarbij de exacte volgorde van de nucleotiden in een bepaald DNA-fragment wordt bepaald. |
| Resultaat | |
| PCR maakt duizenden tot miljoenen kopieën van een bepaald DNA-fragment | Dit resulteert in de juiste volgorde van de basen in een bepaald DNA-fragment. |
| Betrokkenheid van ddNTP's | |
| PCR vereist geen ddNTP's. Het maakt gebruik van dNTP's. | DNA-sequentiebepaling vereist ddNTP's om strengvorming te beëindigen. |
Samenvatting - PCR versus DNA-sequencing
PCR- en DNA-sequentiebepaling zijn zeer belangrijke hulpmiddelen op veel gebieden van de moleculaire biologie. Amplificatie van de DNA-fragmenten wordt gedaan door de PCR-techniek, terwijl de juiste volgorde van de nucleotiden van een DNA-fragment wordt bepaald door de DNA-sequentiebepaling. Dit is het verschil tussen PCR en DNA-sequentiebepaling.
