PCR versus real-time PCR
PCR of Polymerase-kettingreactie is een revolutionaire ontdekking in de moderne moleculaire biologie, die voor het eerst werd ontwikkeld door de chemicus Kary Mullis in 1983. Hiermee kan een enkele sequentie in een complex DNA worden geamplificeerd voor analyse. Het basisidee van de PCR is dat twee primers, die complementair zijn aan de tegenovergestelde strengen van een DNA-sequentie, op elkaar gericht zijn; de primers produceren complementaire strengen, die elk de andere primer bevatten. Het resultaat is dus een grote hoeveelheid van een sequentie die overeenkomt met het DNA dat tussen de twee primers ligt. DNA-polymerase-enzym wordt gebruikt om de primers in PCR te verlengen. DNA-polymerase is een thermostabiel enzym en kan overleven bij hoge temperaturen (94 tot 95 ° C) die worden gebruikt voor denaturatie van template-DNA.
De PCR omvat drie stappen, namelijk herhaalde denaturatieronden, versmelting van primers en synthese van DNA. Een thermocycler-machine wordt gebruikt om deze reactie uit te voeren, zodat deze kan worden geprogrammeerd om de temperaturen snel en nauwkeurig te veranderen. Toepassingen van de PCR zijn strafrechtelijk onderzoek, DNA-vingerafdruk, detectie van pathogenen en analyse van DNA van vroege menselijke soorten.
Wat is conventionele PCR?
Er zijn drie hoofdfasen van conventionele PCR, namelijk; DNA-amplificatiefase, scheiding van PCR en detectie van producten. Scheiding van DNA-segmenten wordt typisch gedaan door middel van agarosegelelektroforese. De producten worden vervolgens gekleurd met etheiduimbromide. Ten slotte wordt detectie bereikt door visualisatie van banden op gels onder UV-licht. Daarom worden de uiteindelijke resultaten van conventionele PCR niet uitgedrukt als getallen. Normaal gesproken kan de conventionele PCR slechts een enkele parameter detecteren.
Wat is real-time PCR?
Real-time PCR kan de amplificatie van producten detecteren, aangezien de producten worden gesynthetiseerd. Met de ontwikkeling van technologie is PCR een zeer populaire techniek geworden, vooral voor de detectie en identificatie van bacteriën in voedingsmiddelen. De real-time PCR maakt gebruik van een fluorescerend kleurstofsysteem en een thermocycler uitgerust met fluorescentiedetectie.
Wat is het verschil tussen conventionele PCR en real-time PCR?
• Conventionele PCR is tijdrovender omdat het gelelektroforese gebruikt om de geamplificeerde PCR-producten te analyseren. Daarentegen is real-time PCR minder tijdrovend omdat het amplificaties kan detecteren tijdens de vroege fasen van de reactie.
• Real-time PCR verzamelt gegevens in de exponentiële groeifase van PCR, terwijl traditionele PCR gegevens verzamelt aan het eindpunt van de reactie.
• De eindpuntresultaten van de conventionele PCR zijn misschien niet erg nauwkeurig, maar de resultaten van de real-time PCR zijn erg precies.
• Real-time PCR is gevoeliger dan conventionele PCR.
• Conventionele PCR heeft een zeer slechte resolutie, terwijl real-time PCR vanwege de hoge resolutie zeer weinig veranderingen kan detecteren.
• Eindpuntdetectie van conventionele PCR heeft een kort dynamisch bereik, terwijl real-time PCR-detectie een groot dynamisch bereik heeft.
• In tegenstelling tot conventionele PCR, worden geautomatiseerde detectietechnieken gevonden in real-time PCR.
• Conventionele PCR is zeer geavanceerd en arbeidsintensief meer dan real-time PCR.
• In tegenstelling tot real-time PCR, kan conventionele PCR geen onderscheid maken tussen dode en levende bacteriën.
• Real-time PCR maakt gebruik van een fluorescent kleurstofsysteem om de producten te detecteren, terwijl conventionele PCR ethidiumbromide en UV-licht gebruikt om banden in het agarosegelmedium te visualiseren.
