Belangrijkste verschil - SYBR Green versus Taqman
SYBR Green en Taqman zijn twee methoden die worden gebruikt om het versterkingsproces van real-time PCR te detecteren of te bekijken. SYBR Green is een methode gebaseerd op het intercaleren van nucleïnezuur-kleurstof, terwijl Taqman een methode is op basis van een hydrolyse-probe. Beide technologieën zijn ontworpen om fluorescentie te genereren tijdens de PCR, waardoor een real-time PCR-machine de reactie in "real-time" kan volgen. SYBR Green-methode wordt uitgevoerd met behulp van een fluorescerende kleurstof genaamd SYBR green en detecteert de amplificatie door de kleurstof te binden aan geproduceerd dubbelstrengs DNA. Taqman wordt uitgevoerd met behulp van dubbel gelabelde probes en detecteert de amplificatie door degradatie van de probe door Taq-polymerase en afgifte van de fluorofoor. Dit is het belangrijkste verschil tussen SYBR Green en Taqman.
INHOUD
1. Overzicht en belangrijkste verschil
2. Wat is SYBR Green
3. Wat is Taqman
4. Vergelijking zij aan zij - SYBR Green versus Taqman
5. Samenvatting
Wat is SYBR Green?
SYBR Green is een fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt om nucleïnezuren te kleuren, met name dubbelstrengs DNA in Molecular Biology. De SYBR Green-methode wordt gebruikt om PCR-producten te kwantificeren tijdens de real-time PCR. Zodra het zich bindt met DNA, absorbeert het resulterende DNA-kleurstofcomplex blauw licht en zendt het intens groen licht uit. Het gebeurt vanwege de structurele verandering die optreedt in het kleurstofmolecuul na binding met dubbelstrengs DNA. Wanneer PCR meer en meer DNA aanmaakt, binden meer kleurstofmoleculen zich met DNA, waardoor er meer fluorescentie ontstaat. Daarom neemt de fluorescentie toe met de accumulatie van het PCR-product. Daarom kan de hoeveelheid PCR-product kwantitatief worden gemeten door de SYBR Green-fluorescentiedetectie.
SYBR groene kleurstof kan ook worden gebruikt voor DNA-labeling in cytometrie en fluorescentiemicroscopie. Ethidiumbromide is met succes vervangen door SYBR Green aangezien Ethidiumbromide een kankerverwekkende kleurstof is met verwijderingsproblemen tijdens DNA-visualisatie in de gelelektroforese.
Er zijn voor- en nadelen van de SYBR-groene methode. Deze methode is erg gevoelig, goedkoop en gemakkelijk te gebruiken. Vanwege het vermogen om te binden aan elk dubbelstrengs DNA, kan niet-specifieke binding echter leiden tot overkwantificering van het PCR-product.
Figuur 01: SYBR Green Technique
Wat is Taqman?
Taqman is een alternatieve methode voor SYBR Green om het real-time PCR-proces te volgen. Deze methode is afhankelijk van de 5 '- 3' exonuclease-activiteit van Taq-polymerase-enzym om de sondes af te breken tijdens de verlenging van de nieuwe streng en het vrijkomen van fluorofoor. Bij deze methode worden twee gelabelde sondes gebruikt en deze is gebaseerd op de hydrolyse van sondes. Probes zijn fluorescent gelabelde DNA-oligonucleotiden met een fluorescerend reportermolecuul (fluorofoor) aan het 5'-uiteinde en een quencher-molecuul aan het 3'-uiteinde. Ze zijn ontworpen om te binden aan de enkelstrengs sjabloon aan de andere kant van de primer anneals. Taq-polymerase voegt nucleotiden toe aan de primer en breidt de nieuwe streng uit naar de dubbel gelabelde probes. Zodra het Taq-polymerase de sonde ontmoet, wordt de exonuclease-actie van het Taq-polymerase geactiveerd en wordt de sonde afgebroken. Zodra de synthese van de nieuwe streng is voltooid, wordt de sonde volledig afgebroken en komt de fluorofoor vrij. Het vrijkomen van fluorofoor genereert fluorescentie. Fluorescerende quencher-molecule dooft efficiënt het uitgezonden licht en creëert de output voor kwantificering van het PCR-product. De afgifte van fluoroforen en de hoeveelheid PCR-producten zijn proportioneel. Daarom kan kwantificering gemakkelijk worden gedaan met de Taqman-methode.kwantificering kan eenvoudig worden gedaan met de Taqman-methode.kwantificering kan eenvoudig worden gedaan met de Taqman-methode.
Figuur 02: Taqman-methode
De Taqman-methode wordt gebruikt in real-time PCR, kwantificering van genexpressie, detectie van genetische polymorfismen, kwantificering van chromosomale DNA-deleties, bacteriële identificatie, verificatie van microarray-analyse, SNP-genotypering enz.
Wat is het verschil tussen SYBR green en Taqman?
Diff Artikel Midden voor Tafel
SYBR Green tegen Taqman |
|
| SYBR Green is gebaseerd op DNA-bindende kleurstof. | Taqman is afhankelijk van hybridisatieprobes en 5 'tot 3' exonuclease-activiteit van Taq-polymerase. |
| Fluorescent gelabelde sondes | |
| Er zijn geen fluorescent gelabelde sondes vereist. | Dubbel gelabelde sondes zijn vereist. |
| Multiplex-genanalyse | |
| Het kan niet worden gebruikt voor multiplex-gen-doelen. | Het kan worden gebruikt voor multiplex-gen-doelen. |
| Kosten | |
| Dit is minder duur. | Dit is duurder. |
| Specificiteit | |
| Dit is minder specifiek en bindt aan elk dubbelstrengs DNA | Deze zijn zeer specifiek omdat probes de specifieke amplificatieproducten detecteren. |
| Effectiviteit | |
| Dit is minder effectief. | Dit is zeer effectief. |
| Toepassing | |
| Dit wordt gebruikt bij real-time PCR, agarosegelvisualisatie, DNA-labeling enz. | Dit wordt gebruikt in real-time PCR, kwantificering van genexpressie, detectie van genetische polymorfismen, enz. |
Samenvatting - SYBR Green en Taqman
Taqman en SYBR green zijn twee methoden die worden gebruikt in real-time PCR (kwantitatieve PCR). Beide methoden maken de kwantificering van het PCR-product efficiënt mogelijk en steunen op de emissie van de fluorescentie. De Taqman-methode maakt gebruik van dubbel gelabelde sondes voor de detectie van het opgehoopte DNA, terwijl de SYBR Green-methode een fluorescerende kleurstof gebruikt. Beide methoden hebben ook verschillende toepassingen in de moleculaire biologie.
