Belangrijkste verschil - Maxam Gilbert versus Sanger-sequencing
Nucleotiden zijn de structurele basiseenheden en bouwstenen van DNA. DNA-molecuul is samengesteld uit een polynucleotideketen. Er zijn vier verschillende nucleotiden gevonden in DNA. Deze nucleotiden zijn samengesteld uit vier verschillende stikstofhoudende basen genaamd A (adenine), G (guanine), C (cytosine), T (thymine). De volgorde van de nucleotiden in het DNA-molecuul is van groot belang omdat het codeert voor belangrijke genetische informatie voor de groei en ontwikkeling van organismen. DNA-sequentiebepaling verwijst naar het proces dat de precieze nucleotidesequentie van het DNA bepaalt. Er zijn verschillende methoden voor het bepalen van de DNA-sequentie. Maxam Gilbert-sequencing en Sanger DNA-sequencing zijn twee methoden voor DNA-sequencing die behoren tot de eerste generatie sequencing. De Maxam Gilbert-sequentiebepalingsprocedure bepaalt de basesequentie door de aan het 5'-uiteinde gelabelde DNA-fragmenten bij voorkeur chemisch te splitsen bij elk van de vier nucleotiden en gelelektroforese. De Sanger-sequencing-procedure bepaalt de nucleotidesequentie door enkelstrengs DNA te synthetiseren met behulp van DNA-polymerase en dideoxynucleotiden en gelelektroforese. Dit is het belangrijkste verschil tussen Maxam Gilbert en Sanger Sequencing.
INHOUD
1. Overzicht en belangrijkste verschil
2. Wat is Maxam Gilbert
3. Wat is Sanger-sequencing
4. Vergelijking zij aan zij - Maxam Gilbert versus Sanger-sequencing
5. Samenvatting
Wat is Maxam Gilbert-sequencing?
Maxam Gilbert-sequencing, ook wel bekend als chemische sequentiemethode, is een techniek die is ontwikkeld om de volgorde van de nucleotiden in het DNA te bepalen. Deze methode werd in 1976 geïntroduceerd door Walter Gilbert en Alan Maxam en werd populair omdat deze direct kan worden uitgevoerd met gezuiverd DNA. De Maxam Gilbert-methode behoort tot de eerste generatie van DNA-sequencing en het was de eerste sequentiemethode die op grote schaal door wetenschappers werd gebruikt.
Het basisprincipe van deze methode ligt bij de beperking van de aan het uiteinde gelabelde DNA-fragmenten op specifieke basen door basisspecifieke chemicaliën en omstandigheden en scheiding van de gelabelde fragmenten door elektroforese, zoals weergegeven in figuur 01. Fragmenten worden gescheiden volgens hun grootte op de gel. Omdat de fragmenten zijn gelabeld, kan de volgorde van het DNA-molecuul gemakkelijk worden afgeleid.
Maxam Gilbert-methode gebruikt basisspecifieke chemicaliën om DNA op specifieke basen te breken. Twee veel voorkomende chemicaliën, dimethylsulfaat en hydrazine-chemicaliën, worden gebruikt om respectievelijk purines en pyrimidines selectief aan te vallen.
De Maxam Gilbert-sequentiemethode wordt als volgt via verschillende stappen uitgevoerd.
- Zuivering van de DNA-sequentie met behulp van restrictie-endonucleasen
- Labeling van de uiteinden van de DNA-fragmenten door toevoeging van radioactieve fosfaten
- Zuivering van de gelabelde fragmenten van niet-gelabelde fragmenten door middel van gelelektroforese
- Scheiding van het aan het uiteinde gelabelde DNA in vier buisjes en afzonderlijk behandelen met basisspecifieke chemicaliën
- Elektroforese van de inhoud van elke buis op afzonderlijke lijnen op een gel en fragmentscheiding op basis van hun lengte.
- Detectie van de fragmenten door autoradiografie.
Figuur 01: Maxam Gilbert-sequencing
Wat is Sanger-sequencing?
Sanger-sequencing is een sequentiemethode die in 1977 door Frederick Sanger en zijn collega's is ontwikkeld om de basesequentie van een bepaald DNA-fragment te bepalen. Het is ook bekend als ketenbeëindigingssequencing of Dideoxy-sequentiemethode. Deze methode werkt volgens het principe van selectieve opname van keten-terminerende dideoxynucleotiden (ddNTP's) zoals ddGTP, ddCTP, ddATP en ddTTP door DNA-polymerase tijdens de synthese van enkelstrengs DNA om de vorming van de streng te beëindigen. Dideoxynucleotiden missen 3 'OH-groepen voor de vorming van fosfodiësterbindingen met aangrenzende nucleotiden. Daarom stopt de strengvorming zodra een ddNTP wordt opgenomen in de nieuw vormende streng tijdens sanger-sequencing.
Bij deze methode worden vier afzonderlijke DNA-synthesereacties (PCR) uitgevoerd in vier afzonderlijke buisjes met één type ddNTP. Andere vereisten worden ook geleverd voor de buisjes voor PCR, waaronder primers, dNTP's, Taq-polymerase, specifieke omstandigheden, enz. Vier afzonderlijke reacties worden uitgevoerd in vier buisjes met vier mengsels. Na PCR-reacties worden de resulterende DNA-fragmenten door warmte gedenatureerd en gescheiden door gelelektroforese. Vervolgens worden de fragmenten gevisualiseerd met behulp van een gelabelde (radioactieve of fluorescerende) primer of dNTP's, zoals weergegeven in figuur 02.
Figuur 02: Sanger-sequencing
Wat is het verschil tussen Maxam Gilbert en Sanger Sequencing?
Diff Artikel Midden voor Tafel
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Maxam Gilbert-sequencing is de eerste techniek die is ontwikkeld voor DNA-sequencing. | De Sanger-sequencing-methode werd geïntroduceerd na de Maxam Gilbert-sequencing-methode. |
| Gebruik | |
| Deze methode wordt zelden gebruikt. | Sanger-sequencing wordt routinematig gebruikt voor sequencing. |
| Gebruik van gevaarlijke chemicaliën | |
| Het maakt gebruik van gevaarlijke chemicaliën. | Het gebruik van gevaarlijke chemicaliën is beperkt in vergelijking met de Maxam Gilbert-methode. |
| Etikettering voor detectie | |
| Deze methode maakt gebruik van radioactief P 32 voor het labelen van de uiteinden van de DNA-fragmenten. | Sanger-sequencing gebruikt radioactief of fluorescerend gelabelde ddNTP's. |
Samenvatting - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert en Sanger-sequencing zijn twee soorten DNA-sequentietechnieken die onder de eerste generatie DNA-sequencing vallen. Maxam Gilbert-sequencing is de eerste methode die in 1976 voor DNA-sequentiebepaling werd geïntroduceerd en wordt uitgevoerd door de aan het einde gelabelde DNA-fragmenten te breken met basisspecifieke chemicaliën. Daarom staat het bekend als chemische sequentiebepaling. De Sanger-sequentiemethode werd geïntroduceerd in 1977 en is gebaseerd op de door ddNTP aangedreven kettingbeëindigingsreacties. Sanger-sequencing-methode populair dan Maxam Gilbert-methode vanwege verschillende nadelen van Maxam Gilbert-methode zoals overmatig tijdverbruik, gebruik van gevaarlijke chemicaliën, enz. Dit is het verschil tussen Maxam Gilbert en Sanger-sequencing.
