Belangrijkste verschil - NGS versus Sanger-sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) en Sanger Sequencing zijn twee soorten nucleotide sequencing-technieken die in de loop van de tijd zijn ontwikkeld. De Sanger Sequencing-methode werd jarenlang veel gebruikt en NGS heeft deze onlangs vervangen vanwege de voordelen ervan. Het belangrijkste verschil tussen NGS en Sanger-sequencing is dat NGS werkt volgens het principe van het gelijktijdig sequencen van miljoenen sequenties op een snelle manier door een sequentiesysteem, terwijl de Sanger-sequencing werkt op het principe van ketenbeëindiging door selectieve opname van dideoxynucleotiden door DNA-polymerase-enzym tijdens de DNA-replicatie en de resulterende fragmentscheiding door capillaire elektroforese.
INHOUD
1. Overzicht en belangrijkste verschil
2. Wat is nucleotide-sequencing
3. Wat is NGS
4. Wat is Sanger-sequencing
5. Vergelijking zij aan zij - NGS versus Sanger-sequencing
6. Samenvatting
Wat is nucleotide-sequencing?
Genetische informatie wordt opgeslagen in de nucleotidesequenties van het DNA of RNA van een organisme. Het proces van het bepalen van de juiste volgorde van nucleotiden (met behulp van vier basen) in een bepaald fragment (in een gen, cluster van genen, chromosoom en volledig genoom) staat bekend als nucleotidesequentie. Het is erg belangrijk in genomische studies, forensische studies, virologie, biologische systematische, medische diagnose, biotechnologie en op vele andere gebieden om de structuur en functie van genen te analyseren. Wetenschappers hebben verschillende soorten sequentiemethoden ontwikkeld. Onder hen werd Sanger-sequencing ontwikkeld door Frederick Sanger in 1977 op grote schaal gebruikt en gedurende een lange periode gepopulariseerd totdat Next Generation Sequencing het verving.
Wat is NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) is een term die wordt gebruikt om te verwijzen naar moderne sequencingprocessen met hoge doorvoer. Het beschrijft een aantal verschillende moderne sequentietechnologieën die een revolutie teweeg hebben gebracht in genomische studies en moleculaire biologie. Die technieken zijn Illumina-sequencing, Roche 454-sequencing, Ion Proton-sequencing en SOLiD-sequencing (Sequencing by Oligo Ligation Detection). NGS-systemen zijn sneller en goedkoper. Vier belangrijke DNA-sequentiemethoden worden gebruikt in NGS-systemen, namelijk; pyrosequencing, sequentiebepaling door synthese, sequentiebepaling door ligatie en ionhalfgeleidersequentiebepaling. Een groot aantal DNA- of RNA-strengen (miljoenen) kan parallel worden gesequenced. Het maakt sequencing van het gehele genoom van organismen binnen een korte tijdsperiode mogelijk, in tegenstelling tot Sanger-sequencing, die meer tijd kost.
NGS heeft veel voordelen ten opzichte van de conventionele Sanger-methode voor sequencing. Het is een sneller, nauwkeuriger en kosteneffectiever proces dat kan worden uitgevoerd met een kleine steekproefomvang. NGS kan worden gebruikt in metagenomische studies, bij de detectie van variaties binnen een individueel genoom als gevolg van inserties en deleties enz. En bij de analyse van genexpressies.
Figuur_1: Ontwikkelingen in NGS-sequencing
Wat is Sanger-sequencing?
Sanger Sequencing is een sequentiemethode die in 1977 door Frederick Sanger en zijn collega's is ontwikkeld om de precieze nucleotidevolgorde van een bepaald DNA-fragment te bepalen. Het is ook bekend als sequencing van ketenbeëindiging of Dideoxy-sequencing. Het werkingsprincipe van deze methode is de beëindiging van strengsynthese door selectieve opname van een keten-terminerende dideoxynucleotiden (ddNTP's) zoals ddGTP, ddCTP, ddATP en ddTTP door DNA-polymerase tijdens de replicatie van DNA. Normale nucleotiden hebben 3 'OH-groepen voor de vorming van een fosfodiësterbinding tussen aangrenzende nucleotiden om de strengvorming voort te zetten. Bij ddNTP's ontbreekt deze 3'-OH-groep echter en kunnen ze geen fosfodiësterbindingen tussen nucleotiden vormen. Daarom wordt de verlenging van de ketting beëindigd.
Bij deze methode dient het enkelstrengs DNA waarvan de sequentie moet worden bepaald, als de matrijsstreng voor in vitro DNA-synthese. Andere vereisten zijn oligonucleotideprimer, deoxynucleotideprecursors en DNA-polymerase-enzym. Wanneer de flankerende uiteinden van het doelfragment bekend zijn, kunnen primers gemakkelijk worden ontworpen voor DNA-replicatie. Vier afzonderlijke DNA-synthesereacties worden uitgevoerd in vier afzonderlijke buisjes. Elke buis heeft afzonderlijke ddNTP's, samen met andere vereisten. Van het specifieke nucleotide wordt een mengsel van dNTP's en ddNTP's toegevoegd. Evenzo worden vier afzonderlijke reacties uitgevoerd in vier buisjes met vier mengsels. Na de reacties worden de detectie van DNA-fragmenten en de omzetting van het fragmentpatroon in sequentie-informatie uitgevoerd. De resulterende DNA-fragmenten worden door warmte gedenatureerd en gescheiden door gelelektroforese. Als radioactieve nucleotiden worden gebruikt, kan het bandpatroon in de polyacrylamidegel worden gevisualiseerd door autoradiografie. Wanneer deze methode gebruikmaakt van de fluorescent gelabelde dideoxynucleotiden, kan dit worden beperkt tot de gel die wordt gelezen en door een laserstraal worden geleid om te worden gedetecteerd door de fluorescerende detector. Om fouten te voorkomen die zouden kunnen optreden wanneer een reeks door het oog wordt gelezen en handmatig in een computer wordt ingevoerd, ontwikkelde deze methode zich tot het gebruik van een geautomatiseerde sequencer die aan de computer is gekoppeld. Om fouten te voorkomen die zouden kunnen optreden wanneer een reeks door het oog wordt gelezen en handmatig in een computer wordt ingevoerd, ontwikkelde deze methode zich tot het gebruik van een geautomatiseerde sequencer die aan de computer is gekoppeld. Om fouten te voorkomen die zouden kunnen optreden wanneer een reeks door het oog wordt gelezen en handmatig in een computer wordt ingevoerd, ontwikkelde deze methode zich tot het gebruik van een geautomatiseerde sequencer die aan de computer is gekoppeld.
Dit is de methode die wordt gebruikt om DNA uit het Human Genome-project te sequencen. Deze methode wordt nog steeds gebruikt met geavanceerde aanpassingen omdat het nauwkeurige sequentie-informatie geeft ondanks dat het een duur en langzaam proces is.
Figuur_2: Sanger-sequencing
Wat is het verschil tussen NGS en Sanger-sequencing?
Diff Artikel Midden voor Tafel
NGS versus Sanger-sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) verwijst naar moderne sequencingprocessen met hoge doorvoer. Het beschrijft een aantal verschillende moderne sequentietechnologieën | Sanger-sequencing is een sequentiemethode die is ontwikkeld door Frederick Sanger om de precieze nucleotidevolgorde van een bepaald DNA-fragment te bepalen. |
| Kosten efficiëntie | |
| NGS is een goedkoper proces omdat het tijd, mankracht en chemicaliën bespaart. | Dit is een kostbaar proces omdat het tijd, mankracht en meer chemicaliën kost. |
| Snelheid | |
| Dit gaat sneller omdat zowel chemische detectie als signaaldetectie van veel strengen parallel plaatsvinden. | Dit is tijdrovend omdat chemische detectie en signaaldetectie plaatsvinden als twee afzonderlijke processen en alleen op streng tegelijk kan worden gelezen. |
| Betrouwbaarheid | |
| NGS is betrouwbaar. | Sanger-sequencing is minder betrouwbaar |
| Steekproefgrootte | |
| NGS vereist minder hoeveelheid DNA. | Deze methode heeft een grote hoeveelheid template-DNA nodig. |
| DNA-basen per gesequenced fragment | |
| Het aantal DNA-basen per gesequenced fragment is lager dan bij de Sanger-methode | Genererende sequenties zijn langer dan NGS-sequenties. |
Samenvatting - NGS versus Sanger-sequencing
NGS en Sanger-sequencing zijn nucleotide-sequentietechnieken die veel worden gebruikt in de moleculaire biologie. Sanger-sequencing is een vroege sequentiemethode die werd vervangen door NGS. Het belangrijkste verschil tussen NGS en Sanger-sequencing is dat NGS een sneller, nauwkeuriger en kosteneffectiever proces is dan Sanger-sequencing. Beide technieken veroorzaakten grote uitbraken in genetica en biotechnologie.
