Belangrijkste verschil - Sanger-sequencing versus Pyrosequencing
DNA-sequentiebepaling is erg belangrijk voor DNA-analyse, omdat kennis van de juiste nucleotidenrangschikking op een bepaald DNA-gebied veel belangrijke informatie daarover onthult. Er zijn verschillende methoden voor het bepalen van de DNA-sequentie. Sanger-sequencing en Pyrosequencing zijn twee verschillende DNA-sequentiemethoden die veel worden gebruikt in de moleculaire biologie. Het belangrijkste verschil tussen Sanger-sequencing en Pyrosequencing is dat Sanger-sequencing dideoxynucleotiden gebruikt om de synthese van DNA te beëindigen om de nucleotidesequentie te lezen, terwijl pyrosequencing de pyrofosfaatafgifte detecteert door de nucleotiden op te nemen en de complementaire sequentie te synthetiseren om de exacte volgorde van de sequentie te lezen.
INHOUD
1. Overzicht en belangrijkste verschil
2. Wat is Sanger-sequencing
3. Wat is Pyrosequencing
4. Vergelijking zij aan zij - Sanger-sequencing versus Pyrosequencing
5. Samenvatting
Wat is Sanger-sequencing?
Sanger-sequencing is een DNA-sequentiemethode van de eerste generatie, ontwikkeld door Frederick Sanger en zijn colleges in 1977. Het is ook bekend als Chain Termination Sequencing of Dideoxy-sequencing omdat het gebaseerd is op kettingbeëindiging door dideoxynucleotiden (ddNTP's). Deze methode werd meer dan 30 jaar op grote schaal gebruikt totdat de New Generation Sequencing (NGS) werd ontwikkeld. De Sanger-sequencing-techniek maakte het mogelijk om de juiste nucleotidevolgorde of de aanhechting van een bepaald DNA-fragment te ontdekken. Het is gebaseerd op de selectieve opname van ddNTP's en beëindiging van de DNA-synthese tijdens de in vitro DNA-replicatie. De afwezigheid van 3 'OH-groepen om de vorming van fosfodiësterbindingen tussen aangrenzende nucleotiden voort te zetten, is een uniek kenmerk van ddNTP's. Vandaar dat zodra de ddNTP is bevestigd, de ketenverlenging stopt en vanaf dat punt eindigt. Er zijn vier ddNTP's - ddATP, ddCTP, ddGTP en ddTTP - die worden gebruikt bij Sanger-sequencing. Deze nucleotiden stoppen het DNA-replicatieproces wanneer ze worden opgenomen in de groeiende DNA-streng en resulteren in verschillende lengtes van kort DNA. Capillaire gelelektroforese wordt gebruikt om deze korte DNA-strengen volgens hun grootte op een gel te ordenen, zoals weergegeven in figuur 01.
Figuur 1: capillaire gelelektroforese van gesynthetiseerd kort DNA
Voor in vitro replicatie van DNA moeten er maar weinig vereisten worden gesteld. Het zijn DNA-polymerase-enzym, template-DNA, oligonucleotide-primers en deoxynucleotiden (dNTP's). Bij Sanger-sequencing wordt DNA-replicatie uitgevoerd in vier afzonderlijke reageerbuizen, samen met vier soorten ddNTP's afzonderlijk. Deoxynucleotiden worden niet volledig vervangen door de respectievelijke ddNTP's. Een mengsel van de specifieke dNTP (bijvoorbeeld; dATP + ddATP) wordt in de buis opgenomen en gerepliceerd. Vier afzonderlijke buisproducten worden op een gel in vier afzonderlijke putjes gelopen. Door de gel te lezen, kan de reeks worden geconstrueerd zoals weergegeven in figuur 02.
Figuur 02: Sanger-sequencing
Sanger-sequencing is een belangrijke techniek die op veel gebieden van de moleculaire biologie helpt. Het menselijk genoomproject werd met succes afgerond met behulp van op Sanger-sequencing gebaseerde methoden. Sanger-sequencing is ook nuttig bij het bepalen van DNA-sequentiebepaling, onderzoek naar kanker en genetische ziekten, analyse van genexpressie, menselijke identificatie, detectie van pathogenen, microbiële sequentiebepaling enz.
Er zijn verschillende nadelen van Sanger-sequencing:
- De lengte van het DNA waarvan de sequentie wordt bepaald, kan niet langer zijn dan 1000 basenparen
- Er kan slechts één streng tegelijk worden gesequenced.
- Het proces is tijdrovend en duur.
Daarom werden in de loop van de tijd nieuwe geavanceerde sequentietechnieken ontwikkeld om deze problemen op te lossen. Sanger-sequencing wordt echter nog steeds gebruikt vanwege de zeer nauwkeurige resultaten tot fragmenten van ongeveer 850 basenparen.
Wat is Pyrosequencing?
Pyrosequencing is een nieuwe techniek voor het bepalen van de DNA-sequentie die is gebaseerd op "sequencing door synthese". Deze techniek is gebaseerd op de detectie van pyrofosfaatafgifte bij de opname van de nucleotiden. Het proces wordt gebruikt door vier verschillende enzymen: DNA-polymerse, ATP-sulfurylase, luciferase en apyrase en twee substraten adenosine 5'-fosfosulfaat (APS) en luciferine.
Het proces begint met de primerbinding met de enkelstrengs DNA-matrijs en DNA-polymerase begint met de opname van complementaire nucleotiden. Wanneer de nucleotiden samenkomen (nucleïnezuurpolymerisatie), geeft het pyrofosfaat (twee aan elkaar gebonden fosfaatgroepen) groepen en energie vrij. Elke toevoeging van nucleotiden geeft een equimolaire hoeveelheid pyrofosfaat vrij. Pyrofosfaat wordt omgezet in ATP door ATP-sulfurylase in aanwezigheid van substraat-APS. Het gegenereerde ATP stimuleert de door luciferase gemedieerde omzetting van luciferine in oxyluciferine, waardoor zichtbaar licht wordt geproduceerd in hoeveelheden die evenredig zijn met de hoeveelheid ATP's. Licht wordt gedetecteerd door een foton detectie-apparaat of door een fotovermenigvuldiger en creëert een pyrogram. Apyrase breekt ATP en niet-opgenomen dNTP's in het reactiemengsel af. dNTP-toevoeging wordt één keer per keer gedaan. Omdat de toevoeging van nucleotide bekend is volgens de opname en detectie van licht, kan de volgorde van de template worden bepaald. Pyrogram wordt gebruikt voor het genereren van de nucleotidesequentie van het monster-DNA, zoals weergegeven in afbeelding 03.
Pyrosequencing is erg belangrijk bij analyse van enkelvoudige nucleotide polymorfisme en sequentiebepaling van korte stukjes DNA. De hoge nauwkeurigheid, flexibiliteit, automatiseringsgemak en parallelle verwerking zijn de voordelen van pyrosequencing ten opzichte van Sanger-sequencing-technieken.
Figuur 03: Pyrosequencing
Wat is het verschil tussen Sanger-sequencing en Pyrosequencing?
Diff Artikel Midden voor Tafel
Sanger-sequencing versus Pyrosequencing |
|
| Sanger-sequencing is een DNA-sequentiemethode gebaseerd op de selectieve opname van ddNTP's door DNA-polymerase en ketenbeëindiging. | Pyrosequencing is een DNA-sequentiemethode die is gebaseerd op de detectie van pyrofosfaatafgifte bij opname van nucleotide. |
| Gebruik van ddNTP | |
| ddNTP's worden gebruikt om de DNA-replicatie te beëindigen | ddNTP's worden niet gebruikt. |
| Enzymen betrokken | |
| DNA-polymerase wordt gebruikt. | Er worden vier enzymen gebruikt: DNA-polymerase, ATP-sulfurylase, luciferase en apyrase. |
| Gebruikte substraten | |
| APS en Luciferin worden niet gebruikt. | Adenosine 5'-fosfosulfaat (APS) en luciferine worden gebruikt. |
| Maximale temperatuur | |
| Dit is een langzaam proces. | Dit is een snel proces. |
Samenvatting - Sanger-sequencing versus Pyrosequencing
Sanger-sequencing en Pyrosequencing zijn twee DNA-sequentiemethoden die in de moleculaire biologie worden gebruikt. Sanger-sequentiebepaling construeert de volgorde van de nucleotiden in volgorde door de ketenverlenging te beëindigen, terwijl de pyrosequentiebepaling de exacte volgorde van de nucleotiden in volgorde construeert door nucleotiden op te nemen en de afgifte van pyrofosfaten te detecteren. Daarom is het belangrijkste verschil tussen Sanger-sequencing en Pyrosequencing dat Sanger-sequencing werkt aan sequencing door kettingbeëindiging, terwijl pyrosequencing werkt aan sequencing door synthese.
