Het belangrijkste verschil tussen helicase en topoisomerase is dat helicase een enzym is dat twee complementaire DNA-strengen scheidt door waterstofbindingen tussen de basen van twee strengen te verbreken, terwijl topoisomerase een enzym is dat positieve en negatieve supercoils verwijdert die zijn gevormd tijdens het afwikkelproces van DNA door te snijden en het opnieuw verzegelen van één of beide strengen van de DNA-duplex.
DNA is een dubbele helix. Het bestaat in twee complementaire strengen die met elkaar zijn verbonden via waterstofbruggen. DNA-replicatie, transcriptie en DNA-reparatie vereisen dat twee strengen van elkaar worden gescheiden om nieuwe kopieën te maken, mRNA te maken en nucleotiden toe te voegen om te repareren. De twee enzymen helicase en topoisomerase spelen op dit punt een rol. Daarom zijn zowel helicase als topoisomerases essentieel bij het afwikkelen van DNA. Helicase scheidt dubbelstrengs DNA in enkele strengen door de waterstofbruggen tussen de nucleotide basenparen in dubbelstrengs DNA te verbreken. Daarentegen ontrafelt topoisomerase de DNA-twist en verlicht het de DNA-supercoil-aard door de DNA-fosfaatruggengraat in één of beide strengen te snijden.
